È noto che la lattoferrina (Lf), una glicoproteina cationica multifunzionale estratta dal colostro o dal latte umano (hLf) o bovino (bLf), efficace nel trattamento di numerose patologie del cavo orale, è in grado di chelare due ioni ferrici per molecola, di inibire la formazione di specie reattive dell’ossigeno, di interagire con le componenti anioniche dei batteri o delle cellule ospiti esercitando un’azione antimicrobica, antiadesiva ed anti-invasiva e di entrare all’interno del nucleo delle cellule svolgendo una significativa attività antinfiammatoria. Il colostro umano o bovino, grazie alla presenza della Lf, dovrebbe esercitare le stesse funzioni della Lf pura, mentre altre funzioni potrebbero essere svolte dagli altri suoi costituenti bioattivi: caseina, α-lattoalbumina, β-lattoglobulina, lisozima, lattoperossidasi e immunoglobuline. La presente ricerca ha lo scopo di verificare se l’attività antibatterica, anti-invasiva ed antinfiammatoria della bLf purificata da colostro (cbLf) e da latte (mbLf) è identica a quella svolta dal colostro intero.
I primi esperimenti sono stati eseguiti al fine di determinare la concentrazione e la purezza della Lf presente nei diversi campioni tramite saggi di controllo di qualità. Dopo aver determinato la concentrazione di bLf presente in ciascun prodotto, si è proceduto a effettuare i test di attività antibatterica, anti-invasiva, anti-sopravvivenza e antinfiammatoria dei diversi prodotti alla medesima concentrazione reale di bLf.
I campioni testati mostravano diverse concentrazioni di bLf. La mbLf presentava una concentrazione reale di bLf di 10 mg/ml sui 10 mg/ml teorici, mentre la cbLf conteneva una concentrazione reale di bLf leggermente inferiore pari a 9,65 mg/ml rispetto ai 10 mg/ml teorici. Concentrazioni molto diverse di bLf sono state evidenziate analizzando il colostro intero, dopo centrifugazione e filtrazione (5,94, 5,64 e 4,62 mg, rispettivamente) rispetto ai 10 mg/ml teorici.
Successivamente, l’attività antibatterica dei diversi prodotti a differenti concentrazioni reali di bLf (5, 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml) è stata testata verso Streptococcus salivarius, componente del microbiota del cavo orale e Streptococcus pyogenes, batterio patogeno intracellulare facoltativo del cavo orale. I test di attività antibatterica nei confronti di S. salivarius hanno evidenziato una blanda inibizione di circa 1,5 log a 6h e 1 log a 24h di contatto da parte della mbLf e della cbLf (alle concentrazioni più alte testate), mentre il colostro intero alle concentrazioni più alte testate inibisce la crescita di questo ceppo di circa 3 log a 6h e circa 2 log a 24h di contatto. Al contrario, il saggio di attività antibatterica nei confronti di S. pyogenes ha evidenziato una forte attività antibatterica della mbLf, soprattutto alle concentrazioni più alte testate, di circa 2,5 log sia a 6 che a 24h di contatto. La cbLf e il colostro intero presentano un’attività antibatterica inferiore ma comunque statisticamente significativa. Questi dati indicano che la mbLf induce una blanda inibizione della crescita di S. salivarius che, infatti, non deve essere inibito in quanto importante componente della barriera protettiva della mucosa orale verso l’ingiuria dei batteri patogeni, mentre inibisce fortemente la crescita di un batterio patogeno come S. pyogenes che deve essere eliminato in quanto dannoso per la salute umana.
Per quanto riguarda l’invasività e la sopravvivenza di S. pyogenes all’interno delle cellule di fibroblasti gengivali primari umani (hPGF), la maggiore attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza è stata esercitata da 100 μg/ml di mbLf. Una inibizione dell’entrata e della sopravvivenza di S. pyogenes nelle hPGF statisticamente significativa è stata riscontrata anche con la cbLf anche se in misura minore rispetto alla mbLf. Il colostro non ha mostrato, invece, alcuna attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza. Questa tendenza è stata osservata anche nei test antinfiammatori: 100 μg/ml di mbLf hanno mostrato un’attività antinfiammatoria più elevata nei confronti della sintesi di IL-6 rispetto a quella osservata da parte di cbLf e del colostro.
Tutti i dati ottenuti sperimentalmente confermano ancora una volta che per ottenere la massima efficacia della Lf nelle sue molteplici attività contro la replicazione, l’invasione e la sopravvivenza batterica, nonché nell’inibire l’infiammazione, questa proteina deve essere formulata e utilizzata senza aggiunta di altre sostanze e deve essere estratta da latte bovino e non da colostro.
Nel 1939, la lattoferrina (Lf) è stata isolata dal latte vaccino come una “frazione rossa” sconosciuta (1).
Nel 1960, per la prima volta, questa proteina rossa del latte umano e bovino fu definita come una glicoproteina appartenente alla famiglia delle transferrine (2,3). La Lf è presente anche nel latte di differenti mammiferi con una concentrazione più elevata nel colostro ed inferiore nel latte maturo (4). È sintetizzata costitutivamente dalle ghiandole esocrine ed è rilasciata nei fluidi biologici come il latte, le lacrime, la saliva, le secrezioni bronchiali, la bile, i fluidi gastrointestinali, l’urina, il plasma e il liquido amniotico (5). È, altresì, prodotta dai neutrofili in seguito ad induzione ed accumulata nei granuli secondari che vengono rilasciati nei siti d’infezione ed infiammazione (6,7). Numerosi studi strutturali hanno stabilito che la Lf è una glicoproteina altamente cationica costituita da due lobi (Lobo N e Lobo C) connessi da tre eliche (8). In ciascun lobo è presente un sito di captazione con cui la Lf lega uno ione ferrico con elevata affinità (Kd=10-20 M). La Lf subisce così un cambio conformazionale: dalla forma aperta in assenza di ferro legato ad una forma chiusa in presenza di ferro chelato (9). La presenza o assenza di ioni ferrici nei siti di captazione condiziona significativamente le funzioni di questa glicoproteina similmente alla presenza ed al tipo di glicani che costituiscono le varie catene di glicosilazione.
I glicani, infatti, sono carboidrati complessi che, insieme con le proteine o i lipidi presenti nelle membrane cellulari, costituiscono le glicoproteine ed i glicolipidi di membrana, macromolecole fondamentali per tutti gli esseri viventi (10) essendo non solo necessari per l’accumulo di energia ma anche per numerosi processi cellulari.
I glicani possono essere raggruppati in tre classi: ad alto contenuto in mannosio, complessi ed ibridi come riassunto nella figura 1 (11).
Molte glicoproteine sono presenti nel colostro e nel latte. Tra queste, la Lf è annoverata tra le più importanti e, come tutte le proteine naturali, è multifunzionale (12) (figura 2).
Come riportato nella figura 2, le attività della Lf sono numerose e associate alle diverse caratteristiche chimico-fisiche della glicoproteina. Infatti, l’attività antimicrobica ed antibiofilm è associata alla capacità della Lf di sottrarre il ferro ai microorganismi che lo utilizzano per potersi replicare. Anche i virus abbisognano del ferro per svolgere il loro ciclo replicativo in quanto tutti gli enzimi necessari alla moltiplicazione virale necessitano di ferro (13). Anche la sintesi dell’esopolisaccaride extracellulare, che insieme ai microrganismi costituisce il biofilm, necessita di ferro disponibile così che in sua assenza il biofilm è più sottile o addirittura assente. Inoltre, grazie alla sua carica positiva, la Lf è in grado di interagire con le strutture anioniche presenti sulla superficie dei batteri con conseguente danneggiamento dei microrganismi. Un esempio è rappresentato dall’interazione tra la Lf ed il lipopolisaccaride dei batteri Gram-negativi che porta alla lisi e, di conseguenza, alla morte dei batteri. La Lf è anche in grado di legarsi ai glicosaminoglicani delle cellule impedendo l’entrata nella cellula dell’ospite dei batteri intracellulari o dei virus. Differentemente dalla transferrina che entra nel citoplasma e lì si localizza, la Lf penetra anche nel nucleo delle cellule dove si lega a specifiche sequenze di DNA che codificano per le citochine proinfiammatorie svolgendo così un’azione antinfiammatoria. Per ciò che riguarda l’azione immunomodulante e antitumorale, l’attività della Lf è influenzata da molti fattori ed i dati, a volte contraddittori, sono ancora oggetto di approfondimento (14).
Tutti gli studi internazionali sono stati eseguiti utilizzando la Lf estratta da latte bovino (bLf), disponibile in grandi quantità e ad un prezzo che ne permette la commercializzazione come integratore alimentare. D’altra parte, la bLf ha un 69% di similarità con la hLf e identiche funzioni biologiche (15). La bLf ha una concentrazione che oscilla da 0,01 a 0,1 g/L nel latte maturo, mentre nel colostro bovino ha una maggiore concentrazione corrispondente a valori che oscillano da 2 a 5 g/L.
Inoltre, nel colostro bovino e nel latte maturo sono state isolate due varianti di Lf: la Lf-a e la Lf-b il cui peso molecolare è stato stimato essere 84.000 Da per la Lf-a e 80.000 Da per la Lf-b. Interessantemente, la Lf nel colostro bovino è rappresentata per un 30% dalla Lf-a e un 70% dalla Lf-b. Nel latte maturo un 15% è rappresentato dalla Lf-a rispetto ad un 85% della Lf-b. Considerando il peso molecolare della Lf sulla base della sequenza dei 689 amminoacidi, esso corrisponde a 77.000 Da, per cui il valore più alto del peso molecolare delle due varianti presenti nel colostro e nel latte è attribuibile alla presenza di diverse catene di glicani.
Infatti, differentemente dalla hLf che possiede solo tre siti di glicosilazione (Asn138, Asn479 e Asn624), la bLf ne possiede cinque (Asn233, Asn281, Asn368, Asn476 e Asn545).
Inoltre, la bLf-a del colostro e del latte maturo è sempre glicosilata in Asn 281, mentre la bLf-b non è mai glicosilata in Asn281. Negli altri siti, entrambe le bLf-a e bLf-b sono glicosilate e mostrano la stessa composizione nelle catene di glicosilazione sia nel colostro che nel latte maturo. Pertanto, le differenze tra queste due Lf sono dovute al fatto che la bLf-a è sempre glicosilata nei cinque possibili siti di glicosilazione, mentre bLf-b è glicosilata solo in quattro dei cinque siti di glicosilazione.
Ulteriori investigazioni hanno rivelato che le catene di glicosilazione nell’Asn281 contengono glicani complessi mentre le catene di glicosilazione nell’Asn233 e nell’Asn545 sono costituite solo da glicani ad alto contenuto in mannosio e quelle nell’Asn368 e nell’Asn476 contengono sia i glicani complessi che quelli ad alto contenuto in mannosio (16).
Come già riportato, dal passaggio dal colostro al latte maturo, la concentrazione della bLf diminuisce ed in particolare, si osserva un valore medio pari a 105,2 mg/L (31.3%) per la bLf-a e 230,8 mg/L (68.7%) per la bLf-b (17).
È importante ricordare che, oltre al colostro ed al latte maturo, tutte le altre secrezioni, che contengono la Lf, bagnano le mucose che, a loro volta, sono colonizzate da microorganismi commensali che costituiscono il microbiota. Il microbiota, in situazioni fisiologiche, costituisce una barriera protettiva nei confronti delle aggressioni dei batteri e virus patogeni che, invece, possono colonizzare le mucose in situazioni patologiche dove il microbiota ha subito una disbiosi.
Il più interessante habitat mucosale naturale è costituito dal cavo orale. Le numerose specie microbiche che costituiscono il microbiota orale giocano, nel cavo orale, un ruolo importante nella correlazione simbiotica con la mucosa e la superficie del dente. La saliva, con tutti i suoi componenti inclusa la Lf, garantisce insieme al microbiota una barriera protettiva fondamentale nel garantire un’importante omeostasi del cavo orale. Infatti, un disordine nell’omeostasi del cavo orale porta ad una disbiosi del microbiota con un cambiamento nel numero, nei generi e nelle specie microbiche che lo costituiscono e ad una pericolosa disbiosi che può potenzialmente danneggiare le essenziali interazioni ospite-microorganismi.
Vari trattamenti sono stati suggeriti per mantenere l’omeostasi del cavo orale, ma nessuno degli approcci proposti ha dimostrato essere curativo nei confronti delle patologie gengivali e parodontali. Attualmente, molti prodotti per l’igiene orale, che tendono a mantenere la corretta omeostasi del cavo orale, contengono il colostro bovino o la bLf purificata. In situazioni fisiologiche, infatti, il microbiota orale e la saliva con la Lf crea una bilanciata correlazione simbiotica con l’ospite che, se perturbata da cambiamenti nel microbiota o dalla composizione della saliva porta a diverse patologie orali (18).
La presente ricerca ha lo scopo di comparare l’attività antibatterica, anti-invasiva ed antinfiammatoria della Lf bovina (bLf) purificata da colostro (cbLf) e da latte (mbLf) rispetto al colostro intero.
Questa comparazione è di grande importanza in quanto, finalmente chiarirebbe l’efficacia del colostro intero nelle varie patologie del cavo orale, dal momento che in letteratura non esistono studi convincenti sulle funzioni del colostro intero. Il solo fatto che il colostro intero contenga la Lf non è sufficiente a definire che il colostro intero svolga le medesime funzioni della Lf pura tra cui la capacità di chelare il ferro, di inibire la moltiplicazione microbica, di inibire l’invasione microbica, di svolgere un’attività antitossica consistente nella neutralizzazione del lipopolisaccaride come pure di svolgere un’azione antinfiammatoria (19,20). Altre funzioni del colostro, invece, sono svolte dai suoi costituenti bioattivi: caseine, α-lattoalbumina, β-lattoglobulina, Lf, lisozima, lattoperossidasi, colostrinina (polipeptide ricco di prolina) e immunoglobuline.
Lo scopo di questo studio è, quindi, evidenziare le similitudini o le differenze nell’attività antibatterica, anti-invasiva ed antinfiammatoria tra la Lf purificata da colostro e da latte rispetto al colostro intero contenente la medesima concentrazione di Lf.
Tutti gli esperimenti di seguito descritti sono stati eseguiti con i seguenti prodotti:
- lattoferrina bovina purificata da colostro (cbLf)
- lattoferrina bovina purificata da latte (mbLf)
- colostro bovino intero.
MATERIALI E METODI
Controllo di qualità delle lattoferrine e del colostro
Primariamente, si è proceduto al controllo di qualità dei prodotti sopra elencati.
A tal fine, sono state allestite delle elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) per verificare la quantità e l’integrità della bLf nei vari prodotti.
Differentemente dalle soluzioni contenenti cbLf e mbLf che appaiono limpide, quelle contenenti il colostro intero mostravano una certa torbidità. Pertanto, sono stati eseguiti differenti trattamenti al fine di poter ottenere una soluzione limpida e poter procedere ad una corretta valutazione della concentrazione della bLf.
In particolare, il colostro intero è stato testato:
- tal quale (senza trattamento)
- dopo centrifugazione a 5000g
- dopo filtrazione a 0,45 micrometri (µm).
Al fine di allestire un’elettroforesi sui due campioni di Lf purificata, 10 mg di cbLf o mbLf sono stati disciolti in 1 ml di acqua distillata e diluiti al fine di ottenere una concentrazione teorica di cbLf o di mbLf pari a 1 mg/ml, da cui sono stati prelevati e caricati su gel di poliacrilammide 20 µl corrispondenti a 20 µg teorici di cbLf o mbLf.
Per ciò che riguarda il colostro, 60 mg, che dovrebbero contenere teoricamente 12 mg di bLf sono stati disciolti in 12 ml di acqua distillata al fine di ottenere una concentrazione teorica di bLf pari a 1 mg/ml (campione tq) da cui sono stati prelevati e caricati su gel di poliacrilammide 20 µl corrispondenti a 20 µg teorici di bLf.
Un’ aliquota di questa soluzione tq è stata anche centrifugata a 5000g x 5 min, mentre un’ulteriore aliquota è stata filtrata con filtri da 0,45 µm. Dalla soluzione centrifugata e filtrata sono stati prelevati e caricati su gel di poliacrilammide 20 µl corrispondenti a 20 µg teorici di bLf.
Titolazione
Le titolazioni sono state eseguite con ioni ferrici per verificare la capacità di chelare il ferro da parte delle tre soluzioni contenenti l’1% teorico di Lf. Suddette soluzioni sono state sottoposte a lettura allo spettrofotometro a 468 nm al fine di saggiare la % di saturazione in ferro iniziale. Occorre ricordare che a 468 nm il coefficiente di estinzione di una soluzione all’1% di Lf, completamente satura in ferro, corrisponde a 0,540 nm. Al momento della dissoluzione, i campioni di cbLf e mbLf risultavano molto solubili e le soluzioni derivanti limpide. Diversamente, il campione tq di colostro presentava un’elevata torbidità che ne inficiava la lettura allo spettrofotometro a 468 nm. Al fine di allontanare eventuali sostanze che causano la torbidità del campione, un’aliquota di questa soluzione è stata centrifugata a 5000g x 5 min, mentre un’ulteriore aliquota è stata filtrata con filtri da 0,45 µm. La centrifugazione a 5000g x 5 min non ha allontanato gli eccipienti non permettendo la lettura allo spettrofotometro, mentre la filtrazione a 0,45 µm ha permesso di ottenere una soluzione limpida e, quindi, idonea alla lettura allo spettrofotometro.
La lettura iniziale della densità ottica (DO) a 468 nm ci permette di saggiare la % di saturazione in ferro iniziale.
Dopo la lettura iniziale, si è proceduto alla titolazione dei campioni mediante aggiunte successive di una soluzione di ioni ferrici al fine di valutare la concentrazione di bLf attiva, ovvero quanti mg dei 10 mg prelevati da ciascun campione, sono attivi e cioè in grado di chelare completamente gli ioni ferrici.
Attività antibatterica di cbLf, mbLf e del colostro
L’attività antibatterica dei tre prodotti (cbLf, mbLf e colostro) è stata testata verso Streptococcus salivarius (commensale del microbiota orale) che non dovrebbe essere inibito dalla bLf essendo un importante componente microbico della barriera protettiva della mucosa orale verso l’ingiuria dei batteri patogeni non sensibile all’azione della bLf. L’attività antibatterica di cbLf, mbLf e colostro è stata saggiata anche verso Streptococcus pyogenes, batterio patogeno intracellulare facoltativo, che, invece, dovrebbe essere inibito dalla bLf. Sono stati utilizzati un ceppo clinico di S. salivarius, batterio Gram-positivo isolato dal cavo orale di un paziente senza nessuna patologia, e un ceppo clinico di S. pyogenes, batterio Gram-positivo isolato da un paziente affetto da faringite. Per verificare l’assenza di eventuali contaminazioni, i ceppi sono stati seminati, prima degli esperimenti, su capsule di Petri contenenti il terreno per la crescita batterica Brain Heart Infusion (BHI) agar (Oxoid LTD, Inghilterra).
Il saggio di attività antibatterica è stato svolto utilizzando diverse concentrazioni (5, 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml) di cbLf, mbLf e di bLf presente nel campione di colostro intero. È importante sottolineare che i campioni di cbLf e di colostro intero presentano una concentrazione di bLf inferiore alla mbLf. Di conseguenza, le quantità di questi prodotti, che sono state messe a contatto con i ceppi batterici, sono state normalizzate sui dati ottenuti dal saggio di SDS-PAGE e dalla titolazione. Per il colostro intero ci siamo basati sui dati ottenuti dopo filtrazione.
In particolare:
- essendo la cbLf pura al 96,5%, 5,18 mg di cbLf sono stati sciolti in 1 ml di BHI per ottenere una concentrazione pari a 5 mg/ml. Per ottenere le concentrazioni di 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml sono state effettuate le opportune diluizioni.
- essendo la mbLf pura al 100%, 5 mg di mbLf sono stati sciolti in 1 ml di BHI per ottenere una concentrazione pari a 5 mg/ml. Per ottenere le concentrazioni di 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml sono state effettuate le opportune diluizioni.
- poiché il colostro filtrato con filtri da 0,45 µm, contiene 4,62 mg di bLf, 65 mg di colostro sono stati sciolti in 1ml di BHI per ottenere una concentrazione pari a 5 mg/ml. Per ottenere le concentrazioni di 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml sono state effettuate le opportune diluizioni.
Prima degli esperimenti, tutte le soluzioni sono state sterilizzate utilizzando filtri Millex HV da 0,2 µm (Millipore Corp., Bedford, USA).
Un’aliquota di 20 µl dei ceppi congelati di S. salivarius e S. pyogenes sono stati coltivati overnight in terreno di coltura BHI broth a 37°C. Dopo la crescita overnight, i ceppi sono stati inoculati ad una concentrazione di 5×105 batteri/ml in 1 ml di BHI broth in assenza e in presenza di concentrazioni decrescenti (5, 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml) di cbLf, mbLf e di bLf presente nei campioni di colostro intero ed incubati a 37°C. Il numero di batteri vitali è stato determinato, dopo opportune diluzioni, mediante la conta delle unità formanti colonie (UFC)/ml su capsule Petri contenenti il terreno BHI agar dopo 6 e 24h di contatto di ciascun prodotto con i ceppi batterici.
Attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza di cbLf, mbLf e del colostro
Per gli esperimenti, il ceppo S. pyogenes è stato coltivato in BHI broth per 18h a 37°C. Trascorse le 18h, è stato effettuato un nuovo passaggio della brodocultura di S. pyogenes in un nuovo terreno per 2h a 37°C al fine di avere il ceppo batterico in fase di crescita esponenziale da utilizzare per infettare i monostrati cellulari.
- Linea cellulare: la linea cellulare Human Primary Gingival Fibroblast (hPGF) (ATCC, USA) è stata propagata in flask da 75 cm2 (Corning, Italia) contenente 10 ml di terreno di coltura Fibroblast Basal Medium (ATCC, USA) supplementato con il kit Fibroblast Growth Kit–Low Serum (ATCC, USA) ed incubata a 37°C in un incubatore con atmosfera al 5% di CO2. Il kit Fibroblast Growth Kit–Low Serum contiene 7.5 mM di L-glutammina, 5 ng/ml di fattori di crescita ricombinanti umani dei fibroblasti, 5 µg/ml di insulina ricombinante umana, 1 µg/ml di idrocortisone, 50 µg/ml di acido ascorbico, il 2% di siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomicina.
- Preparazione dei campioni: l’attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza della cbLf, mbLf e del colostro intero nei confronti di S. pyogenes, testata sulla linea cellulare hPGF, è stata utilizzata ad una concentrazione reale di bLf di 100 µg/ml. In particolare, 5,18 mg di cbLf, 5 mg di mbLf e 65 mg di colostro sono stati diluiti fino ad ottenere una concentrazione pari a 100 µg/ml. Prima degli esperimenti in vitro, tutte le soluzioni sono state sterilizzate utilizzando filtri Millex HV da 0,2 µm (Millipore Corp., Bedford, USA).
- Saggio di invasione e sopravvivenza: per il saggio di invasione, sono state utilizzate multiwells da 24 pozzetti contenenti 1×104 cellule/well, incubate per 48h a 37°C in un incubatore umidificato con atmosfera al 5% di CO2. Trascorse le 48h di incubazione, il terreno è stato eliminato dalle multiwells e, successivamente, è stato effettuato un lavaggio con phosphate buffered saline (PBS) (Oxoid LTD, Inghilterra) dopo il quale è stato aggiunto nuovo terreno senza FBS, per evitare la possibile interazione tra la Lf e la transferrina sierica, e senza penicillina/streptomicina per evitare che possibili tracce di antibiotico possano inficiare l’efficienza di entrata dei batteri. Le multiwells sono state incubate a 37°C per 2h in un incubatore con atmosfera al 5% di CO2.
Trascorse le 2h di incubazione, si è proceduto al saggio di invasione e sopravvivenza. Nello specifico, dopo aver eliminato il terreno cellulare ed effettuato un lavaggio con PBS, un pozzetto contenente il monostrato cellulare è stato incubato a 37°C per 5 min con tripsina (Merck, Italia) al fine di distaccare le cellule ed effettuare la conta cellulare. La conta delle cellule, pari a 3,1±0,6×104 cellule/well, è utile per stabilire esattamente il numero di batteri da inoculare. Per questo saggio è stata scelta la molteplicità di infezione (MOI) di S. pyogenes pari a 100. La MOI indica quanti batteri vengono messi a contatto con un numero noto di cellule per pozzetto (3,1±0,6×104 cellule/well). Nel nostro esperimento, per avere una MOI 100 abbiamo messo a contatto 3,1±0,6×106 batteri per 3,1±0,6×104 cellule che è pari a 100 batteri per ogni cellula.
L’attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza della cbLf, mbLf e del colostro intero nei confronti di S. pyogenes, a MOI 100, è stata testata aggiungendo ogni singola sostanza al monostrato cellulare al momento dell’infezione con S. pyogenes.
Dopo aver inoculato i batteri sui monostrati cellulari in assenza e in presenza delle diverse sostanze, le multiwells sono state incubate per 2h a 37°C in atmosfera al 5% di CO2. Dopo 2h di incubazione, il terreno di coltura è stato eliminato dalle multiwells, sono stati effettuati 3 lavaggi con PBS e sono stati aggiunti 200 µg/ml di gentamicina (Sigma Aldrich, Italia) in terreno cellulare, senza FBS e penicillina/streptomicina, al fine di uccidere gli eventuali batteri extracellulari. Le multiwells sono state incubate per 1h a 37°C in atmosfera al 5% di CO2. Trascorsa l’ora di incubazione, per il saggio di invasione, il terreno per le cellule contenente 200 µg/ml di gentamicina è stato allontanato e conservato a -80°C per il saggio di attività antinfiammatoria e sono stati effettuati 5 lavaggi con PBS. Il monostrato cellulare è stato, quindi, lisato con lo 0,1% (v/v) di Triton X-100 (Sigma Aldrich, Italia), tensioattivo che a questa concentrazione è in grado di lisare le cellule umane mantenendo i batteri vitali. Il numero di batteri intracellulari è stato determinato, dopo opportune diluzioni, mediante conta delle UFC/ml su capsule Petri contenenti il terreno BHI agar. L’efficienza di invasione è stata calcolata come UFC/ml di S. pyogenes e come rapporto tra il numero dei batteri intracellulari a 3h e quello dell’inoculo. Inoltre, è stata anche calcolata l’attività anti-invasiva delle diverse sostanze nei confronti di S. pyogenes.
Per il saggio di sopravvivenza, il terreno cellulare contenente 200 µg/ml di gentamicina è stato allontanato. I monostrati cellulari sono stati incubati per 24h a 37°C con atmosfera al 5% di CO2 con 100 µg/ml di gentamicina in nuovo terreno senza FBS e penicillina/streptomicina. Trascorse le 24h di incubazione, il terreno contenente 100 µg/ml di gentamicina è stato allontanato da ogni pozzetto e conservato a -80°C per il saggio di attività antinfiammatoria e sono stati effettuati 5 lavaggi con PBS. Il monostrato cellulare è stato, quindi, lisato con lo 0,1% (v/v) di Triton X-100 e il numero di batteri intracellulari è stato determinato, dopo opportune diluizioni, mediante conta delle UFC/ml su capsule Petri contenenti il terreno BHI agar. L’efficienza di sopravvivenza è stata calcolata come UFC/ml di S. pyogenes e come rapporto tra il numero dei batteri intracellulari a 24h e quelli a 3h. In questo caso il controllo è stato settato al 100% e i campioni trattati sono stati normalizzati al 100% del controllo. Inoltre, è stata anche calcolata l’attività anti-sopravvivenza delle diverse sostanze nei confronti di S. pyogenes.
Attività antinfiammatoria
Il saggio di attività antinfiammatoria dei singoli prodotti nei confronti della produzione della citochina pro-infiammatoria IL-6 da parte delle cellule hPGF infettate con S. pyogenes è stato effettuato utilizzando il kit commerciale Human ELISA Max Deluxe Sets (BioLegend, San Diego, CA, USA). Per l’analisi dei livelli di IL-6, i terreni di coltura delle cellule non infettate e infettate con S. pyogenes, in assenza e presenza di cbLf, mbLf e del colostro intero dopo 3h (2h di infezione più 1h di gentamicina a 200 µg/ml) e 24h post-infezione sono stati sottoposti a saggio ELISA.
Analisi statistica
Per gli esperimenti di attività antibatterica, anti-invasiva, anti-sopravvivenza e antinfiammatoria, le differenze statisticamente significative sono state calcolate tramite one-way ANOVA e test post-hoc di Tukey. Questa analisi ci permette di confrontare non solo il controllo con i campioni trattati, ma ci permette di avere un’analisi statistica anche tra le diverse condizioni dei campioni trattati. Le analisi statistiche sono state effettuate tramite il software Prism v7 (software GraphPad, San Diego, CA, USA). I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (DS) di due esperimenti indipendenti. Un p-value ≤ 0,05 è considerato statisticamente significativo.
RISULTATI
Controllo di qualità delle lattoferrine e del colostro
I risultati ottenuti dalle elettroforesi in gel di poliacrilamide (SDS-PAGE) per verificare la quantità e l’integrità della bLf nei vari prodotti sono riportati in figura 3 (elettroforesi) e figura 4 (densitometria).
A)
- Pesi molecolari
- 20 µl mbLf
- 20 µl cbLf
B)
- Pesi molecolari
- 20 µl mbLf
- VUOTO
- 20 µl colostro tal quale
- 20 µl colostro centrifugato a 5000g x 5 min
- 20 µl colostro filtrato con filtro da 0,45 µm
Come si può notare dai gel elettroforetici, la quantità di mbLf è pari al valore teorico, quella di cbLf è un po’ inferiore al teorico mentre la bLf contenuta nel colostro intero è molto inferiore al valore teorico. Nella Tabella 1 sono riportate le percentuali di bLf integra presente nei campioni di mbLf, cbLf e nel colostro intero.
Come si può notare dalla tabella 1, la mbLf appare integra al 100%, in quanto il valore teorico di 1 mg/ml di mbLf corrisponde ad un valore reale di 1 mg/ml.
Per quanto riguarda la cbLf, la concentrazione di bLf integra è pari al 96,5%, in quanto il valore teorico di 1 mg/ml di mbLf corrisponde ad un valore reale di 0,965 mg/ml. La minore concentrazione di cbLf era ipotizzabile a causa della presenza di una banda di degradazione all’altezza di circa 45 kDa (linea 3 della figura 3A).
Per ciò che riguarda il colostro intero, la preparazione tal quale presenta una concentrazione di bLf integra pari al 49,5%, quella del campione centrifugato è pari al 47% e quella filtrata è pari al 38,5%. Di conseguenza, 60 mg di colostro, che dovrebbero contenere 12 mg teorici di bLf, contengono realmente 5,94, 5,64 e 4,62 mg reali di bLf nel campione tal quale, centrifugato e filtrato, rispettivamente, indicando una concentrazione di bLf minore del 50%.
Titolazione
La titolazione dei campioni di cbLf, mbLf e del colostro filtrato a 0,45 µm è riportata nella tabella 2.
Attività antibatterica di cbLf, mbLf e del colostro
I risultati dell’attività antibatterica della cbLf, mbLf e del colostro intero nei confronti di S. salivarius sono riportati in figura 5.
Come si può notare nella figura 5A, si assiste ad una diminuzione statisticamente significativa della carica di S. salivarius in presenza di cbLf, mbLf e di colostro intero a tutte le concentrazioni testate. Queste diminuzioni sono particolarmente evidenti quando il ceppo di S. salivarius è stato messo a contatto con alte concentrazioni (5, 2, 1 mg/ml) di bLf contenuta nel colostro intero, mentre per la cbLf e mbLf queste diminuzioni sono meno evidenti (figura 5A).
Una diminuzione statisticamente significativa di S. salivarius è osservata anche a 24h di contatto con cbLf, mbLf e colostro intero alle concentrazioni di bLf pari a 5, 2, 1 e 0,5 mg/ml (figura 5B). Anche in questo caso, queste diminuzioni sono particolarmente evidenti quando il ceppo di S. salivarius è stato messo a contatto con il colostro intero, mentre per la cbLf e mbLf queste diminuzioni risultano meno evidenti (figura 5B). Infatti, il colostro intero inibisce significativamente la crescita di S. salivarius dimostrando un suo effetto negativo sulla barriera microbica protettiva non dovuto alla bLf ma piuttosto ad altri componenti del colostro.
I risultati dell’attività antibatterica della cbLf, mbLf e del colostro intero nei confronti di S. pyogenes sono riportati in figura 6. Come si può notare nella figura 6A, la cbLf, mbLf e il colostro intero a tutte le concentrazioni testate svolgono un’attività antibatterica statisticamente significativa nei confronti di S. pyogenes. In particolare, una potente diminuzione di S. pyogenes viene osservata in presenza di mbLf alle concentrazioni di 5, 2, 1 e 0,5 mg/ml di bLf, mentre per la cbLf e il colostro intero l’inibizione è meno evidente (figura 6A).
Dopo 24h di contatto con il ceppo di S. pyogenes, cbLf, mbLf e colostro presentano un’attività antibatterica statisticamente significativa alle concentrazioni di 5, 2, 1, 0,5 e 0,2 mg/ml di bLf (figura 6B). Tale attività risulta essere dose-dipendente (figura 6B) e simile per le tre sostanze testate (figura 6B).
Attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza di cbLf, mbLf e del colostro
I risultati dell’attività anti-invasiva del cbLf, mbLf e del colostro intero nei confronti di S. pyogenes sulla linea cellulare hPGF sono riportati in figura 7.
Come si può notare dalla figura 7A e B, la mbLf e cbLf diminuiscono significativamente l’entrata di S. pyogenes nella linea cellulare hPGF, mentre il colostro intero non influenza l’entrata del ceppo batterico. In particolare, la mbLf e la cbLf risultano inibire l’entrata di S. pyogenes rispettivamente di circa il 75 e il 60%, mentre il colostro intero non presenta un’attività anti-invasiva statisticamente significativa presentando un’inibizione di circa il 15% (figura 7C).
I risultati dell’attività anti-sopravvivenza della cbLf, mbLf e del colostro nei confronti di S. pyogenes sulla linea cellulare hPGF sono riportati in figura 8.
Anche nel saggio di sopravvivenza, la mbLf e la cbLf presentano un’attività di killing intracellulare del ceppo di S. pyogenes statisticamente significativa rispetto al colostro intero (figura 8A e B). Nello specifico, la mbLf e cbLf presentano un’attività anti-sopravvivenza rispettivamente del 60 e 40% (figura 8C). Il colostro presenta un’attività anti-sopravvivenza di circa il 15% che non risulta essere statisticamente significativa (figura 8C).
Attività antinfiammatoria
Per quanto riguarda l’attività antinfiammatoria, l’analisi del sopranatante a 3h post-infezione non evidenziava livelli di IL-6 determinabili tramite saggio ELISA (<0 pg/ml), mentre i risultati alle 24h post-infezione sono riportati in figura 9.
Preliminarmente, sono stati misurati i livelli di IL-6 anche sulle cellule hPGF non infettate e trattate con la cbLf, mbLf e con il colostro intero. I livelli della citochina pro-infiammatoria IL-6 sono simili al controllo costituito da cellule non infettate. Quindi, nella figura 9 è stato riportato solo il controllo cellule non infettato e non trattato.
Come si può notare dalla figura 9, S. pyogenes induce la produzione di IL-6 (circa 100 pg/ml) rispetto alle cellule non infettate e sia la mbLf che la cbLf riescono a diminuire i livelli di questa citochina pro-infiammatoria. Nello specifico, la mbLf riesce ad abbassare i livelli di IL-6 alla concentrazione riscontrata nelle cellule non infettate, mentre una diminuzione meno evidente ma statisticamente significativa è osservata anche con la cbLf (figura 9). Anche se in maniera meno evidente rispetto alla mbLf e cbLf, il colostro intero riesce ad abbassare i livelli di IL-6 rispetto alle cellule infettate con S. pyogenes (figura 9). Di nota, l’attività antinfiammatoria della mbLf è statisticamente significativa rispetto agli altri due prodotti testati (figura 9).
CONCLUSIONI
Questo studio ha permesso di mettere in evidenza l’attività antibatterica, anti-invasiva, anti-sopravvivenza e antinfiammatoria della mbLf, cbLf e del colostro intero nei confronti di un ceppo di S. pyogenes. La prima serie di esperimenti è stata indirizzata a determinare la concentrazione e la purezza della bLf presente nei diversi campioni. Nello specifico, i test di controllo di qualità hanno evidenziato che i campioni testati presentavano diverse concentrazioni di bLf.
La mbLf presentava una concentrazione reale di bLf di 10 mg/ml sui 10 mg/ml teorici, mentre la cbLf conteneva una concentrazione reale di bLf leggermente inferiore pari a 9,65 mg/ml rispetto ai 10 mg/ml teorici. Importante, inoltre, sottolineare che nel gel, si evidenzia una banda di degradazione all’altezza di circa 45 kDa (linea 3 della figura 1A) che può essere giustificata dal fatto che questa preparazione è pura al 96,5%.
Concentrazioni molto diverse sono state evidenziate analizzando il colostro. 60 mg di colostro, che dovevano contenere teoricamente 12 mg di bLf, presentavano, invece, una concentrazione reale di questa glicoproteina pari a 5,94 mg. Il colostro è stato sottoposto, pertanto, a centrifugazione a 5000 g per 5 min e a filtrazione a 0,45 µm al fine di allontanare eventuali eccipienti ed eliminare la torbidità. I risultati dell’SDS-PAGE hanno evidenziato che il colostro intero, dopo centrifugazione e filtrazione, presentava livelli di bLf ancora più bassi per il campione di colostro filtrato e centrifugato (5,64 e 4,62 mg, rispettivamente). Questi dati potrebbero indicare che la bLf si lega a qualche componente presente nel colostro intero o potrebbe precipitare dopo centrifugazione o rimanere nelle maglie del filtro dopo filtrazione e, quindi, non essere presente nella soluzione finale.
Per quanto riguarda il saggio di titolazione, la mbLf presenta una saturazione in ferro pari al 9,44% che rientra nel range di saturazione della hLf e pertanto paragonabile a quella che si può riscontrare in vivo sempre nella hLf. Inoltre, per quanto riguarda la capacità di chelare il ferro, questo campione di Lf è attivo al 100%.
La cbLf, invece, presenta una saturazione in ferro molto elevata, pari al 62,97% che potrebbe inficiare la sua attività antibatterica ferro-dipendente. Per quanto riguarda la capacità di chelare il ferro, questo campione di Lf è attivo al 95,5%. Questa differenza rispetto alla mbLf (100%) può essere dovuta alla banda di degradazione all’altezza di 45 kDa, riscontrata tramite saggio SDS-PAGE, che potrebbe non essere in grado di chelare il ferro e, quindi, non essere attiva.
Per quanto riguarda il colostro intero, il saggio di titolazione ha evidenziato una saturazione in ferro della Lf presente nel campione pari al 19,26%, mentre per quanto riguarda la capacità di chelare il ferro, questo campione di Lf è attivo solo al 57,4%. È importante sottolineare che questo prodotto è stato sottoposto al saggio di titolazione dopo processo di filtrazione. La Lf attiva riscontrata dal saggio di titolazione, pari al 57,4% (5,74 mg), risulta essere superiore alla Lf integra riscontrata dal saggio di SDS-PAGE dopo lo stesso processo di filtrazione, pari a 4,62 mg. Questa discrepanza può essere dovuta alla formazione di frammenti di bLf (lobo N e lobo C) che sono capaci ancora di chelare gli ioni ferrici ma non possono essere identificati tramite SDS-PAGE. Infatti, come risulta dal saggio di SDS-PAGE, nel colostro sono presenti molte proteine che portano alla formazione di molte bande dal peso molecolare identico o molto simile ai frammenti di Lf.
Dopo aver determinato la concentrazione di Lf presente in ciascun prodotto, si è proceduto ad effettuare i test di efficacia dei diversi prodotti alla medesima concentrazione reale di Lf.
L’attività antibatterica dei diversi prodotti a differenti concentrazioni di bLf (5, 2, 1, 0,5, 0,2 e 0,1 mg/ml) è stata testata verso S. salivarius, componente del microbiota del cavo orale, e S. pyogenes, batterio patogeno intracellulare facoltativo del cavo orale. I test di attività antibatterica nei confronti di S. salivarius hanno evidenziato una blanda inibizione di circa 1,5 log a 6h e 1 log a 24h di contatto da parte della mbLf e della cbLf (alle concentrazioni più alte testate), mentre il colostro intero alle concentrazioni più alte testate inibisce la crescita di questo ceppo di circa 3 log a 6h e circa 2 log a 24h di contatto. Al contrario, il saggio di attività antibatterica nei confronti di S. pyogenes ha evidenziato una forte attività antibatterica della mbLf, soprattutto alle concentrazioni più alte testate, di circa 2,5 log sia a 6 che a 24h di contatto. La cbLf e il colostro intero presentano un’attività antibatterica inferiore ma comunque statisticamente significativa. Questi dati indicano che la mbLf induce una blanda inibizione della crescita di S. salivarius che è un importante componente della barriera protettiva della mucosa orale verso l’ingiuria dei batteri patogeni, mentre inibisce fortemente la crescita di un batterio patogeno come S. pyogenes. L’attività antimicrobica della Lf può essere sia dipendente che indipendente dalla sua capacità di legare il ferro (12,21). Grazie alla sua capacità di chelare due ioni ferrici per molecola fino a valori di pH 3,0, la bLf esercita un’azione batteriostatica producendo un ambiente carente di ferro e riducendo così la crescita batterica. L’attività battericida della bLf nei confronti dei batteri Gram-positivi, come S. pyogenes, è dovuta alle interazioni elettrostatiche tra lo strato lipidico batterico, carico negativamente, e la superficie positiva della bLf, causando cambiamenti nella permeabilità della membrana batterica (20). Inoltre, l’attività antibatterica della mbLf era già stata osservata nei confronti di S. mutans, tra i più importanti agenti eziologici delle carie dentali, causando anche un’inibizione della formazione di biofilm di questo ceppo (22). Diversamente dalla mbLf e dalla cbLf, il colostro intero riesce ad inibire la crescita di entrambi i ceppi, indicando che la sua attività è aspecifica e dipende non solo dalla bLf ma anche da altri componenti ad attività antibatterica presenti nei campioni.
Per quanto concerne l’entrata e la sopravvivenza di S. pyogenes nella linea cellulare hPGF, questo ceppo risulta essere capace di entrare e sopravvivere all’interno dei fibroblasti gengivali. La più potente attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza è svolta dalla mbLf che riesce ad inibire in questa linea cellulare sia l’entrata di S. pyogenes, probabilmente legandosi ad un componente della struttura batterica e/o delle cellule umane, che la sopravvivenza del ceppo, tramite un’azione di killing intracellulare. Una inibizione dell’entrata e della sopravvivenza di S. pyogenes nelle hPGF statisticamente significativa è stata riscontrata anche con la cbLf anche se in misura minore rispetto alla mbLf. Per quanto riguarda il colostro intero, questo prodotto non mostra un’attività anti-invasiva e anti-sopravvivenza statisticamente significativa nei confronti di S. pyogenes.
Infine, questo trend è mantenuto anche nell’attività antinfiammatoria, dove S. pyogenes induce un aumento dei livelli di IL-6 nelle cellule hPGF rispetto al controllo non infettato e la mbLf riporta la concentrazione di IL-6 a livello fisiologico. Questi dati ci indicano che la mbLf pura ed integra riesce ad abbassare i livelli di IL-6 nelle cellule umane grazie alla sua capacità di entrare nel nucleo cellulare e regolare l’espressione di citochine pro-infiammatorie come l’IL-6, come dimostrato in un ampio numero di studi (18,21,23-26). La cbLf diminuisce i livelli di IL-6 rispetto al controllo infettato anche se in misura minore rispetto alla mbLf e un trend simile è mantenuto nella condizione sperimentale in cui è presente il colostro intero.
Sebbene il colostro intero abbia molti peptidi ad azione antibatterica ed antinfiammatoria, negli esperimenti di attività anti-invasiva ed anti-sopravvivenza, come pure nell’attività antinfiammatoria, questi prodotti non risultano essere efficaci come la mbLf e cbLf.
Complessivamente, la mbLf mostra una più potente attività antibatterica, anti-invasiva, anti-sopravvivenza ed antinfiammatoria rispetto alla cbLf e al colostro intero anche se i meccanismi molecolari alla base di queste maggiori attività sono da approfondire.
In conclusione, tutti i dati ottenuti sperimentalmente confermano ancora una volta che per ottenere la massima efficacia della lattoferrina nelle sue molteplici attività contro la replicazione, l’invasione e la sopravvivenza batterica, nonché l’infiammazione, questa proteina deve essere formulata e utilizzata senza aggiunta di altre sostanze e deve essere estratta da latte bovino e non da colostro. Infatti, la Lf estratta da latte bovino è integra, satura in ferro similmente alla hLf e significativamente la più efficace nel trattamento di una vasta gamma di patologie del cavo orale associate ad un’azione antimicrobica, anti-invasiva ed antinfiammatoria.
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The first experiments were performed in order to determine the concentration and purity of the Lf present in the different samples through quality control assays. After determining the concentration of bLf present in each product, tests were carried out on the antibacterial, anti-invasive, anti-survival and anti-inflammatory activity of the different products at the same actual concentration of bLf.
It is known that lactoferrin (Lf), a multifunctional cationic glycoprotein extracted from colostrum or human (hLf) or bovine (bLf) milk, effective in the treatment of numerous oral pathologies, is capable of chelating two ferric ions per molecule, to inhibit the formation of reactive oxygen species, to interact with the anionic components of bacteria or host cells, exerting an antimicrobial, anti-adhesive and anti-invasive action and to enter the cell nucleus, carrying out a significant anti-inflammatory activity. Human or bovine colostrum, thanks to the presence of Lf, should perform the same functions as pure Lf, while other functions could be performed by its other bioactive constituents: casein, α-lactalbumin, β-lactoglobulin, lysozyme, lactoperoxidase and immunoglobulins. The present research aims to verify whether the antibacterial, anti-invasive and anti-inflammatory activity of bLf purified from colostrum (cbLf) and milk (mbLf) is identical to that carried out by whole colostrum.
The tested samples showed different concentrations of bLf. The mbLf had a real bLf concentration of 10 mg/ml compared to the theoretical 10 mg/ml, while the cbLf contained a slightly lower real bLf concentration of 9.65 mg/ml compared to the theoretical 10 mg/ml. Very different concentrations of bLf were highlighted by analyzing whole colostrum, after centrifugation and filtration (5.94, 5.64 and 4.62 mg, respectively) compared to the theoretical 10 mg/ml.
Subsequently, the antibacterial activity of the different products at different real concentrations of bLf (5, 2, 1, 0.5, 0.2 and 0.1 mg/ml) was tested against Streptococcus salivarius, a component of the oral cavity microbiota and Streptococcus pyogenes, facultative intracellular pathogenic bacterium of the oral cavity. The antibacterial activity tests against S. salivarius showed a mild inhibition of approximately 1.5 log at 6h and 1 log at 24h of contact by mbLf and cbLf (at the highest concentrations tested), while whole colostrum at the highest concentrations tested it inhibits the growth of this strain by approximately 3 log at 6h and approximately 2 log at 24h of contact. On the contrary, the antibacterial activity assay against S. pyogenes highlighted a strong antibacterial activity of mbLf, especially at the highest concentrations tested, of approximately 2.5 log at both 6 and 24 hours of contact. CbLf and whole colostrum have a lower but still statistically significant antibacterial activity. These data indicate that mbLf induces a mild inhibition of the growth of S. salivarius which, in fact, must not be inhibited as it is an important component of the protective barrier of the oral mucosa against the damage of pathogenic bacteria, while it strongly inhibits the growth of a bacterium pathogen such as S. pyogenes which must be eliminated as it is harmful to human health.
Regarding the invasiveness and survival of S. pyogenes within human primary gingival fibroblast (hPGF) cells, the greatest anti-invasive and anti-survival activity was exerted by 100 μg/ml mbLf. A statistically significant inhibition of the entry and survival of S. pyogenes in hPGFs was also found with cbLf although to a lesser extent than with mbLf. Colostrum, however, did not show any anti-invasive and anti-survival activity. This trend was also observed in anti-inflammatory tests: 100 µg/ml of mbLf showed a higher anti-inflammatory activity towards IL-6 synthesis compared to that observed by cbLf and colostrum.
All the data obtained experimentally confirm once again that to obtain maximum effectiveness of Lf in its multiple activities against bacterial replication, invasion and survival, as well as in inhibiting inflammation, this protein must be formulated and used without addition of other substances and must be extracted from bovine milk and not from colostrum.
 del latte umano e bovino fu definita come una glicoproteina appartenente alla famiglia delle transferrine){kind=link}